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VOL.18 Nº4, OCTUBRE/DICIEMBRE 2007

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Caracterización de tres mutaciones en el gen de la antitrombina

INTRODUCCIÓN

La antitrombina (AT) es una glucoproteína de síntesis hepática con peso molecular de 58kDa, que pertenece a la superfamilia de las serpinas y se caracteriza, al igual que la mayoría de las serpinas, por su actividad inhibitoria de enzimas con actividad serin proteasa (de ahí su nombre: SERin Proteasa INhibitors) (1). La AT es el principal anticoagulante endógeno, pues inhibe a la enzima procoagulante más importante, la trombina (FIIa), y a otras enzimas de la coagulación como son los factores Xa, IXa, XIa y XIIa. La deficiencia incluso moderada de la molécula aumenta el riesgo trombótico hasta un 50%, y la deficiencia completa de la proteína esta asociada con la letalidad embrionaria (2). Por todo ello, la AT es quizás el principal elemento regulador del sistema hemostático con mayor trascendencia funcional.

En 1965 el hematólogo noruego Olav Egeberg presentó el primer estudio que asociaba un defecto hereditario del control de la coagulación, precisamente deficiencia de AT, con la enfermedad tromboembólica (3). Comprobó que los sujetos con niveles reducidos de AT (en un rango del 40- 50% respecto a sujetos sanos) desarrollaban episodios severos y tempranos de trombosis venosa (3). Así, la publicación de Egeberg inició la trombofilia como un área de investigación relevante y como una disciplina clínica importante. La primera mutación descrita en el gen de la AT y responsable de una deficiencia fue en 1983 (4), y desde entonces más de 184 mutaciones distintas han sido identificadas en pacientes con trombosis venosa, la mayoría en estado heterocigoto (5-7). Sin embargo, pese a ser un trastorno severo que aconseja su estudio en situaciones de trombofilia, su incidencia es muy baja. En la población general se estima que 1/1400 (0,07%) sujetos sanos presenta una deficiencia de AT (8). Por otra parte, la incidencia en patología tromboembólica venosa tampoco es muy elevada. Aproximadamente un 2% de los pacientes con trombosis venosa (rango que oscila entre el 1 y 8%) tienen déficit de este anticoagulante (9). Además, como ocurre con otras mutaciones puntuales severas, la mayor parte de las mutaciones descritas han sido identificadas en una sola familia, y son raros los casos en los que se identifica la misma alteración en sujetos no relacionados.

La identificación de nuevas mutaciones en el gen de la AT puede ayudar a conocer nuevos aspectos funcionales y estructurales del principal anticoagulante del sistema hemostático. Por ello, el objetivo de nuestro trabajo fue estudiar la base molecular de la deficiencia de AT en 3 familias trombofílicas españolas.

MATERIAL Y MÉTODOS

Pacientes y análisis de trombofilia

1. Familias con deficiencia de Antitrombina. Tres familias trombofílicas españolas fueron estudiadas por presentar factores de riesgo trombótico.

Familia 1: Es una familia con una clara evidencia de historia trombofílica familiar (4 antecesores desarrollaron evento trombótico antes de los 70 años). El propositus fue un varón de 57 años de edad con hipercolesterolemia como único factor de riesgo, que tras sufrir un severo dolor abdominal se le realizaron las pruebas radiológicas correspondientes. El estudio mediante tomografía computarizada reveló una trombosis de la vena mesentérica superior. Ante esto se le instauró un tratamiento anticoagulante (acenocumarol 3mg/día) durante 9 meses. Sin embargo, la retirada del tratamiento provocó un nuevo dolor abdominal en el paciente, y aunque no se pudo objetivar un nuevo episodio de trombosis se le estableció un tratamiento anticoagulante oral indefinido.

Familia 2: Se trata de una extensa familia caucasiana con una elevada incidencia de episodios trombóticos (10 de los 33 miembros sufrieron algún evento trombótico). El propositus fue una mujer de 29 años que desarrolló un episodio de trombosis venosa profunda a los 20 años de edad asociado a cirugía y al consumo de anticonceptivos orales.

Familia 3: Estudiamos una familia trombofílica en la que el propositus, un varón de 45 años sin ningún factor de riesgo trombótico venoso o arterial conocido, presentó un episodio agudo de aplasia y hemiplejia del brazo y pierna derecha.

El estudio mediante resonancia magnética y tomografía computerizada de la cabeza, reveló un infarto en el territorio de la arteria cerebral anterior derecha. Además, el paciente mostró elevada fiebre (38-39ºC) que cursó con una broncopulmonía bilateral. El estudio mediante eco-doppler de los vasos del cuello y angiografía por tomografía computerizada mostró la presencia de un trombo en la arteria carótida interna izquierda causando una obstrucción de la luz arterial de más del 70%.

Análisis de trombofilia: En las 3 familias se realizó un estudio trombofílico familiar que incluyó la determinación de anticuerpos anti-fosfolípidos, proteína C, proteína S, deficiencia de AT, niveles de fibrinógeno, FVIII y homocisteína en plasma y resistencia a la proteína C activada. Evaluamos los dos polimorfismos protrombóticos clásicamente reconocidos, FV Leiden (FVL) y protrombina G20210A (PT), y uno recientemente identificado por nuestro grupo (ZPI, R67X) (10). La funcionalidad de la AT se determinó por su capacidad de inhibir al FXa, empleando FXa bovino y substrato cromogénico específico (S-2765) (Instrumentation Laboratory). Los niveles antigénicos fueron medidos por inmunodifusión (Laurell). El análisis genético implicó la amplificación mediante PCR de los 7 exones de la AT, su purificación en gel de agarosa al 1,5% y posterior secuenciación (ABI prism Big Dye con el kit de secuenciación 377), usando los dos primers empleados en la amplificación. El estudio conformacional de la AT fue evaluado por métodos electroforéticos siguiendo las indicaciones previamente publicadas por nuestro grupo (11). Finalmente usamos la técnica de inmunoelectroforesis cruzada para determinar la presencia de AT con baja afinidad por heparina.

2. Estudio caso-control. La pevalencia de la AT Cambridge II fue evaluada en un estudio caso- control que incluyó 1018 pacientes consecutivos con al menos un episodio confirmado de tromboembolismo venoso antes de los 75 años y 1018 controles sin historial trombótico, de las mismas zonas y sexo, y similar edad que los pacientes. Las muestras procedieron de 4 hospitales españoles: Hospital General Universitario (Murcia), Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Barcelona), Hospital Clínico Universitario (Salamanca) y Clínica Universitaria de Navarra (Pamplona). El estudio genético de la AT Cambridge II implicó amplificación del exón 6 de la AT mediante PCR. La identificación de la mutación causante de la AT Cambridge (Ala384Ser) se realizó mediante una PCR de alelo especifico seguido de análisis de restricción (PCR-ASRA) con la enzima Pvu II (New England Biolabs, Hitchin,England). Los casos positivos los confirmamos mediante secuenciación (ABI prism Big Dye con el kit de secuenciación 377).

Estudio funcional de la AT Cambridge II: Plasma citratado de 20 portadores de la AT Cambridge II (16 en heterocigosis y 4 en homocigosis), y de 17 controles sin la mutación se emplearon para realizar los estudios funcionales. Además de determinar la actividad Anti-FXa de la AT, se analizó la actividad Anti-IIa empleando trombina bovina y sustrato cromogénico específico (Ethylmalonyl- S-Pro-Arg-pNA. AcOH-CBS 61.50) (STA Antithrombin, Diagnostica Stago). Para la realización de estos ensayos funcionales empleamos dos tipos de heparinas: heparina no fraccionada y heparina de bajo peso molecular (bemiparina), ambas cedidas por los Laboratorios Rovi S.A. Los niveles antigénicos fueron medidos por inmunodifusión (Laurell).

Los resultados fueron expresados como porcentaje con respecto a un pool de plasma de 100 controles sanos.

Análisis estadístico: Las variables continuas las expresamos como media ± desviación estándar. La comparación de medias absolutas entre los 2 grupos se realizó mediante las pruebas de t de Student no apareada o el test de chi-cuadrado. El test chi-cuadrado se empleó para realizar un análisis estadístico univariable. El cálculo de la odds ratio (OR) para el estudio caso control se realizó por el software EpiInfo (Centro de control de enfermedades, Atlanta, Georgia, USA). Diferencias con valores de p >0.05 las hemos considerado estadísticamente significativas.

Todos los sujetos incluidos en el estudio, miembros de las familias portadoras de deficiencia de AT y pacientes del estudio caso-control, dieron su consentimiento informado para entrar en el estudio, de acuerdo a la declaración de Helsinki de 1975, modificada en 1983.

RESULTADOS

1. Identificación de la base molecular de las deficiencias de AT en las familias trombofílicas.

Familia 1. Identificamos 2 alteraciones protrombóticas en esta familia: FVL y deficiencia congénita de AT tipo I. Tres miembros de una rama de la familia portaron FVL y 4 familiares de otra rama presentaron deficiencia congénita de AT, entre los que se encontró el propositus como muestra la figura 1A. El análisis genético reveló una mutación en heterocigosis en el exón 4 de la AT que consiste en la inserción de una timina en posición aminoacídica 7429-30 (Figura 1B). Esta mutación causó un cambio en la fase de lectura provocando la aparición de un codón stop prematuro en posición 240. Este resultado justifica la deficiencia tipo I que detectamos en los portadores (38,3% de nivel antigénico y 41,5% de actividad funcional) (Figura 1C).

Familia 2. Identificamos 3 alteraciones genéticas protrombóticas: FVL, PT y deficiencia de AT. Destacamos que 11 miembros de la familia portaban dos factores de riesgo genético (3 PT+/-& FVL+/-, 7 PT+/- & deficiencia AT +/- y 1PT +/+) y 2 pacientes (I-6, I-8) portaron los tres factores (Figura 2A). Desde el punto de vista clínico la coexistencia de factores de riesgo se asoció con mayor incidencia de episodios trombóticos, menor edad de aparición de la primera trombosis y mayor índice de recurrencia (Figura 2B).

El estudio genético de la AT mostró una mutación puntual en heterocigosis localizada en el exón 3a (g.5904 A>G, c.546 A>G) responsable del cambio aminoacídico Lys125Arg (Figura 3A) que a pesar de afectar al sitio de unión a heparina (característico de deficiencias tipo II) (Figura 3B) produjo una deficiencia tipo I (58.6% de nivel antigénico y 59.5% de actividad funcional). De hecho, el estudio de AT plasmática mediante inmunoelectroforesis cruzada no reveló aumento de la forma con baja afinidad por heparina (Figura 3C).

Fig. 1

Fig. 1. A) Familia 1. Pedigrí de la familia trombofílica española estudiada con propositus identificado con una flecha. Se indica el tipo y localización del evento trombótico, recurrencia y niveles antigénicos y funcionales de AT. Los símbolos representan los factores de riesgo genético identificados. B) Análisis de secuencia del exón 4 de la AT del propositus, mostrando la inserción de una Timina en posición 7429-30, que causa la aparición de un codón stop prematuro en posición 240. C) Valores funcionales y antigénicos de la AT en miembros de la familia agrupados por genotipo InsT 7429-30.

Fig. 2

Fig. 2. A) Familia 2. Pedigrí de la segunda familia trombofílica estudiada con el propositus identificado con una flecha. Tipo y localización de evento trombótico, recurrencia, otros factores de riesgo y niveles antigénicos y funcionales de la AT son indicados. Los símbolos hacen referencia a los factores de riesgo identificados en esta familia. B) Consecuencias clínicas de la coexistencia de factores genéticos de riesgo: Incidencia de trombosis, edad de aparición de 1ª trombosis y recurrencia.

Familia 3. Identificamos una familia trombofílica cuyos análisis bioquímicos fueron normales, y las pruebas de trombofilia negativas, excepto una ligera deficiencia funcional (80.4%) y antigénica de la AT (87.9%). La severa clínica y la historia familiar de trombosis (Figura 4A) justificó la secuencia de todas las regiones codificantes y regiones flanqueantes del gen de la AT, cuyos resultados revelaron una única mutación puntual en heterocigosis localizada en el exón 6 (g.1246 G>T) responsable del cambio aminoacídico Ala384Ser (Figura 4B). Esta mutación corresponde a la AT Cambridge II, que confirmamos por PCR-ASR (Figura 4C). Cuatro miembros de las 3 generaciones estudiadas de esta familia mostraron la misma mutación, todos ellos en heterocigosis.

Por último destacar que los análisis electroforéticos no revelaron conformaciones anormales de la AT en ninguna de las 3 familias estudiadas.

2. Papel trombótico de la AT Cambridge II.

La mutación puntual afectó a un residuo alanina conservado en la familia de las serpinas, localizado en una región estructuralmente relevante en el mecanismo de acción inhibitoria de las serpinas: residuo P10 del centro reactivo, justo en la bisagra proximal (Figura 5). Esta mutación fue detectada únicamente en 2 controles (0.2%): 2 mujeres de 31 y 42 años no relacionadas. En contraste, la mutación se presentó en 17 pacientes (1,7%) de trombosis venosa. En todos los casos la mutación fue identificada en estado heterocigoto. Estos resultados indican que la AT Cambridge aumenta el riesgo trombótico hasta 8 veces (p= 0.001; 95% CI: 1,9-54,2). Análisis multivariante determinó que la AT Cambridge II es un factor genético de riesgo trombótico independiente (p= 0.002; OR= 9.75; 95% CI: 2.2-42.5).

Fig. 3

Fig. 3. Familia 2. A) Mutación identificada en el exón 3a del gen de la AT. B) Residuos involucrados en el dominio de unión a heparina de la AT. Identificamos el residuo afectado por la mutación Lys125Arg. C) Inmunoelectroforesis cruzada del plasma del paciente I-6.

Fig. 4

Fig. 4. A) Familia 3. Árbol genealógico de la familia estudiada con el propositus identificado con una flecha. Los portadores de la mutación Cambridge II se muestran con el símbolo relleno. B) Identificación de la mutación A384S en la secuencia del gen de la AT. C) Identificación mediante PCR-ASRA con Pvu II de la AT Cambridge II.

Efecto funcional de la AT Cambridge II. Evaluamos las consecuencias funcionales de esta mutación en 37 sujetos, 17 controles y 20 portadores de la mutación Ala384Ser (16 en heterocigosis y 4 en homocigosis). Los niveles antigénicos y funcionales anti-Xa (en presencia de heparina no fraccionada y heparina de bajo peso molecular, bemiparina) estuvieron dentro del rango de la normalidad en portadores y controles, y sólo encontramos diferencias significativas cuando comparamos niveles de actividad anti-Xa, en presencia de heparina no fraccionada, de controles y de portadores homocigotos (100.2±4.3% vs. 91.7±10.5%, respectivamente p= 0.016). La actividad anti-IIa en presencia de heparina no fraccionada estuvo ligera pero significativamente reducida en portadores, (79,3±7.8%; rango 66,9- 90,8%) frente a los controles (100,0±7,9%; rango 87,5-118,0%); p< 0,001. Adicionalmente, observamos un significativo efecto gen-dosis en este parámetro. Así, la actividad anti IIa en portadores heterocigotos en presencia de heparina no fraccionada fue del 81,8±6,6 % (rango 70,6- 90.8%) mientras que en homocigotos fue del 69,5±2,4% (rango 66,9-72,6%); p= 0,002. La actividad anti IIa, en presencia de heparina de bajo peso molecular también estuvo reducida significativamente en portadores frente a los controles (90,1±9,5%, rango 73,4-107,6% vs. 100,6±7,5%, rango 84,9-113,2; p> 0,001) y encontramos diferencias significativas entre heterocigotos y homocigotos (92.4±9.1%, rango 73.4- 107,6% vs. 81,0±3,6%, rango 76,5-85,1%; p= 0,027).

Localización de la AT Cambridge II (A384S) en la estructura tridimensional de la AT.
Fig. 5. Localización de la AT Cambridge II (A384S) en la estructura tridimensional de la AT.

DISCUSIÓN

La trombosis venosa es una enfermedad de gran relevancia en nuestra sociedad debido a su elevada incidencia, superior a 1 caso por cada 1000 habitantes y por año y debido a su elevada morbimortalidad (12). Esta situación justifica la búsqueda de nuevos factores genéticos que sean capaces de incrementar el riesgo trombótico. Este estudio podría ayudar a definir nuevos marcadores trombóticos que afectaran a relevantes proteínas hemostáticas como la AT, permitiendo definir diagnósticos y tratamientos terapéuticos más precisos y seguros.

La localización más frecuente de la trombosis es el sistema venoso profundo, sin embargo existen otros lugares diana de trombosis de gran relevancia debido a su severidad, como puede ser trombosis de venas mesentéricas. Aunque la trombosis de venas mesentérica es infrecuente, son sitios característicos de trombosis en sujetos con deficiencia de AT. Así entre un 8,3% y un 10,4% de pacientes sintomáticos con deficiencia de AT sufren trombosis de la vena mesentérica superior (13). Nosotros identificamos un nuevo caso de trombosis de la vena mesentérica superior asociado con deficiencia congénita de AT. La inserción de un único nucleótido, timina en posición nucleotídica 7429-30 no descrita previamente (5), en estado heterocigoto causó un cambio en la fase de lectura y la aparición de un codón stop prematuro en posición 240. Este caso muestra similitud con otro paciente con deficiencia congénita de AT (insT7384 que causa aparición de un codón stop prematuro en posición 232) que desarrolló un episodio de trombosis de la vena mesentérica superior (14). Además, los únicos tres casos de trombosis de la vena mesentérica superior asociados a una deficiencia genética de AT encontrados en la literatura se asocian con la aparición de un codón stop prematuro en posiciones: 240,232 y 365 (14,15). Finalmente, en todos los casos de trombosis de la vena mesentérica superior asociados a una deficiencia congénita de AT, ésta fue tipo I (clínicamente más severa). Esto apoya que un elevado riesgo trombótico o un estado hipercoagulable muy severo es necesario para desarrollar trombosis mesentérica. Por tanto, debido a la gravedad clínica de la trombosis mesentérica y a que un 10% de pacientes con deficiencia de AT tienen trombosis de la vena mesentérica superior, sugerimos que ante los primeros síntomas clínicos de esta enfermedad en pacientes con deficiencia de AT se le deberían realizar inmediatamente las pruebas diagnósticas de trombosis mesentérica.

Actualmente se sabe que, la trombosis venosa es una enfermedad poligénica y multifactorial, resultado de la interacción de factores de riesgo genéticos y ambientales. Por ello, la coexistencia de factores de riesgo supone un aumento significativo del riesgo trombótico (16). El estudio de familias en las que coexistan factores de riesgo genético, aunque sean infrecuentes, ayuda a definir el papel de cada alteración genética, así como la relevancia de su interacción. Son raros los casos en los que se combina algún factor de riesgo a una deficiencia de AT sin embargo, nosotros identificamos una familia trombofílica en la que además de identificar una nueva mutación en el gen de la AT (Lys125Arg), no incluida en ninguna base de datos de mutaciones de AT (Imperial College of London; OMIM; HGMD) (6,7) o de serpinas (17), detectamos su coexistencia con otras 2 alteraciones protrombóticas: FVL y PT. A pesar de que la mutación detectada en la AT afecta a un residuo de unión a heparina, los portadores no tuvieron un déficit tipo II de la molécula, sino un tipo I severo. Este efecto puede explicarse por la relevancia estructural del residuo afectado. Destacamos que la AT, al igual que el resto de las serpinas, se caracteriza por una enorme flexibilidad estructural, crucial para el correcto desarrollo de su función anticoagulante. Sin embargo, dicha propiedad la hace especialmente sensible a diferentes factores (genéticos y ambientales) que puedan afectar a su estructura y a su funcionalidad (18). De esta manera, la mutación del residuo Lys125, aminoácido altamente conservado, podría impedir interacciones con otros residuos de la molécula ocasionando la disrupción de la hélice D, que comprometería la organización estructural de la molécula completa, resultando una molécula no secretada. Esta es una situación similar a lo descrito para la mutación, Leu126Pro, que afecta al residuo adyacente (19). Clínicamente, nuestros resultados confirman que la acumulación de factores genéticos incrementa de forma sinérgica el riesgo trombótico, en incidencia, severidad y recurrencia. Esto apoya que pacientes con acumulación de factores de riesgo trombótico deben recibir una profilaxis antitrombótica más intensa ya que la terapia convencional puede resultar ineficaz.

Finalmente los resultados más interesantes son los obtenidos del estudio de la AT Cambridge II. Demostramos que la AT Cambridge II no es exclusiva de población británica. Nuestros resultados confirman que la mutación está presente en el 0,2% de la población española sana, un porcentaje idéntico al de la población británica, y en el 1,7% de pacientes con trombosis venosa. Estos datos apoyarían que la mutación responsable de la AT Cambridge II se comportada de manera intermedia entre un polimorfismo (como el FVL, con alta prevalencia en la población) y una mutación (infrecuente, pero con elevo riesgo trombótico). La trascendencia clínica de esta alteración que per se es importante, tiene más trascendencia con los estudios funcionales, ya que indican que esta mutación pasaría desapercibida con el empleo de los sistemas clásicos de diagnóstico de deficiencia de AT. Así, los niveles antigénicos y funcionales anti-Xa de portadores fueron normales. El único dato funcional que hacía suponer que esta alteración causase una deficiencia de AT era una reducida actividad anti-IIa. El cambio A384S, que afecta al residuo P10, es responsable mediante múltiples mecanismos alostéricos, de que la forma variante se comporte como substrato del FXa y especialmente de la trombina, particularmente en presencia de heparina no fraccionada. Así, en presencia de heparina, los portadores de esta alteración tenían una capacidad de inhibición del FXa y trombina 3 y 7 veces menor, respectivamente, que la forma nativa no mutada, confirmando los datos de un estudio previo (20).

Estos resultados sugieren evaluar con precaución los estudios de trombofilia obtenidos de sistemas clásicos, usados rutinariamente en clínica para diagnosticar la deficiencia de AT (medida de niveles antigénicos y actividad anti-FXa), pues la AT Cambridge II pasaría desapercibida. Finalmente destacamos que esta mutación es de gran relevancia en estudios de trombofilia ya que, el porcentaje de pacientes con deficiencia de AT debidas a esta alteración es igual al conjunto del resto de deficiencias de AT.

AGRADECIMIENTOS

Este artículo ha sido realizado gracias a la financiación de los proyectos SAF 2003-00840, SAF 2006-06212 y la Red RECAVA (ISCIII). Adriana Ordóñez ha sido becaria predoctoral de la “Fundación Mapfre Medicina” en la Universidad de Murcia. Los resultados de este estudio han sido publicados en las siguientes revistas internacionales: 1) Thromb Res 2007; In press. Bagnobianchi A, Ordóñez A, Minano A, et al. A novel mutation in the antithrombin gene (insT 7429-30) causes superior mesenteric vein thrombosis. 2) Thromb Haemost 2007; 97: 153-5. A Ordóñez, C de Cos; A Miñano, et al. Coexistence of three genetic risk factors in a Spanish Thrombophilic Family: factor V Leiden,Prothrombin 20210 and a new Type I antithrombin deficiency. 3) Blood 2007; prepublished online. J Corral, D Hernández-Espinosa, J M Soria, et al. Antithrombin Cambridge II (A384S): an underestimated genetic risk factor for venous thrombosis.

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